樣本的收集及保存操作不當(dāng)會影響ELISA實(shí)驗結(jié)果嗎？

　　本生ELISA(酶聯(lián)免疫試驗)以其靈敏度較高、特異性好的特點(diǎn)已廣泛用于科研實(shí)驗及臨床，越來越多科研單位選擇用ELISA實(shí)驗方法完成研究課題。優(yōu)*的試劑、好的儀器和正確的操作是保證ELISA試劑盒檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件，但樣本的收集及保存操作不當(dāng)也會影響ELISA實(shí)驗結(jié)果。樣本的收集跟保存聽上去貌似很簡單，但不乏有許多科研工作者因為樣本的收集跟保存沒做好而影響實(shí)驗結(jié)果。

　　下面針對樣本收集及保存提幾點(diǎn)建議：

　　1.嚴(yán)重溶血，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性;

　　2.混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈;如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)：

　　3.標(biāo)本凝固不全，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果;

　　4.采血試管洗滌不、反復(fù)使用易交叉污染：塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。

　　血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存;使用一次性玻璃試管或真空管采血管;并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān);EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性;血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?/p>

　　被檢血清或血漿標(biāo)本，可用含保護(hù)性封阻劑(吐溫-20)或稱濕潤劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進(jìn)行孵育。此種被試標(biāo)本可作一系列稀釋度測定，也可用一個稀釋度測定。對于作某一個傳染病的診斷來說，最好先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度(即測定劑量反應(yīng)曲線)，然后用一個稀釋測定即可。最適稀釋度和孵育時間均需從實(shí)踐中摸索出來，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷，以1：200稀釋度測定比較適當(dāng)，而試驗標(biāo)本的(即含抗體)作用時間一般為室溫或37℃ 1-2小時。但現(xiàn)在對有些標(biāo)本(如流腦抗原)測定時，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。

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